（十）石油微生物种群的分离

随着对各海域石油的开采利用，石油对海区污染将不可避免地影响生态平衡及渔获量。为解决这个间题，可利用能降解石油的微生物．这首先要对此类微生物分离筛选。选出降解石油能力强的菌株进行培养利用．

1 ．培养基配制

（1）港湾盐培养基配制：

NaCl 10 克

MgCl₂·6H₂O聽聽 2.3 克

KCl聽聽聽 0.3 克

加蒸馏水至1 升

（2）基础培养基配方：

葡萄糖2.0 克

酵母汁1.0克

酪蛋白氨基酸（酪蛋白水解物）聽聽 5.0克

纯琼脂20克

加海水1000 毫升

在高压灭菌前调整供细菌用的pH7.0 ，供霉菌和酵母菌用的要调至5.5 ，高压灭菌各培养基，冷至44 ℃ 后，供细菌用的，每升加10 毫克的抑真菌剂；供真菌和酵母菌用的，每升加链霉素和四环素各50 毫克，摇匀后，制成平板培养基。

（3）油盐培养基（双倍浓度）:

KNO₃聽聽 2.0 克

MgSO₄ 聽聽聽1.0克

汽油（无去垢的）10.0毫升

蒸馏水1000毫升

① 硅酸钾配制。在100 毫升的7%KOH 溶液内加热溶解吸。10克的硅酸胶。

② 加酚红指示剂（1.003%）于双倍浓度油盐培养基中。

③ 分别取① 和② 各50毫升于121 ℃ 蒸汽下灭菌巧分钟．

④ 当油盐培养基冷至室温时，加0.5 毫升的KH2PO4和1 毫升的20%磷酸．

⑤ 将50 毫升的硅酸钾溶液（pH6-7 桔红色）倾至50毫升的油盐培养基中，迅速混匀．而后各倒20 毫升于每个培养皿中，制成平板培养基．

⑥ 划线前平板培养基应是干燥的，小的培养皿可作为微孔过滤样品的微生物数量计算。

2 ．分离步骤

（1）用采样器分别从石油污染海区和相对无污染海区取水样和底泥样品。

（2）分别移l 毫升水样和1 克底泥样，各放于稀释试管内，按10 倍稀释法，稀释至10^-4

（3）摇匀稀释液后，各用无菌移液管吸取适量的原水样及各稀释度水样和泥样注入每一类型的平板培养基上，各作双份。

（4）用无菌玻瑞曲棒涂匀平板培养基上的接种样，

（5）接种后的培养皿于20℃ 温箱中颠倒培养．

（6）异养型细菌可培养7 天，观察计算其菌落，利用石油的微生物．培养14天而后观察记数．

（7）从培养的细菌中，取出不同类型的菌落，在单浓度油盐培养基上，加上汽油5%做生长实验。

3 ．将实验记录填于表2-6

表2-6 石油微生物种群分离实验记录表

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