目的

根据中华人民共和国国家标准（GB17009-1997）“风疹诊断标准及处理原则”，对风疹病毒分离作必要的细化和补充，规范风疹病毒分离方法。

适用范围

本操作细则适用于从咽拭子、尿液标本中分离风疹病毒。

操作细则

原理：病毒感染其敏感的靶细胞后，利用宿主细胞的细胞器、酶类及其能量进行病毒核酸复制，引起宿主细胞的形态学改变，出现细胞融合、坏死和脱落。

1、试剂来源

Vero/slam细胞由国家麻疹实验室提供，使用代次不超过15代。

2、操作步骤

2.1维持液的配制聽聽聽聽 100ml
聽聽聽聽聽 DMEM聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 96mL
聽聽聽聽聽 7.5%碳酸氢钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 1mL
聽聽聽聽聽 胎牛血清聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽2mL
聽聽聽聽聽 青链霉素（10000U/mL)聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 1mL

2.2细胞制备

在生物安全柜中将生长良好的成片Vero/slam细胞瓶塞拔下，倒去培养液，加4mLEDTA胰酶混合消化液，盖上瓶塞，当肉眼可见细胞层变成淡白色或显微镜下细胞开始圆缩为度，拔去瓶塞，倒去消化液，加入10mL生长液，用吸管沿瓶壁吹打，使细胞充分混匀。按所需细胞浓度加入营养液分装,10mL/瓶或5mL/瓶，放37℃孵箱内培养。传代后2～3天，在显微镜下观察单层细胞，以确保细胞生长良好，备用。

2.3标本的处理

2.3.1咽拭子标本：低温冻融三次，冻存于-70℃以下，备用。

2.3.2尿液标本：标本采集后24小时内送达试验室，离心处理（4℃,2000rpm,20分钟），弃上清，加入标本保存液1mL，低温冻融三次，冻存于-70℃以下，备用。

2.4标本的接种

2.4.1将标本融化，无菌吸取0.2－0.5mL（根据细胞瓶大小决定）接种到生长良好的单层vero/slam细胞瓶中，接种前倒去细胞培养液，使待检样品均匀地覆盖在细胞上，置35℃孵箱内吸附1~2小时，吸附期间应轻轻摇动2~3次，以避免细胞面干燥。另留1瓶细胞作为阴性对照。每一份标本接种1瓶细胞，并进行正确标记（包括标本编号、接种日期、传代数）。

2.4.2吸附完毕后，为防止标本对细胞产生毒性反应，弃去标本液，加入细胞维持液，每瓶5mL—10mL（大方瓶10mL/瓶，小方瓶5mL/瓶）。放35℃孵箱内培养。

2.5 结果观察

2.5.1每天在显微镜下观察方瓶中的细胞病变（CPE），并记录融合性细胞的产生过程。如果培养基太酸（由橙色变为黄色），需要更换细胞维持液。

2.5.2当出现典型的融合巨细胞病变+++时。将该瓶培养物冻存于-70℃冰箱，备作病毒鉴定之用。

2.5.3如经7天培养未出现细胞病变，则再盲传1代继续观察7天。由于风疹病毒的细胞病变不明显,连续传代2次的分离物应进行病毒鉴定后方可报告结果。

2.5.4细胞病变（CPE）的观察记录格式为：
聽聽聽聽聽 0～25%的细胞出现病变记录为“+”；
聽聽聽聽聽 25%～50%的细胞出现病变记录为“++”；
聽聽聽聽聽 50%～75%的细胞出现病变记录为“+++”；
聽聽聽聽聽 75%～100%的细胞出现病变记录为“++++”。

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