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聽聽聽 酶联免疫吸附技术（Enzyme-Linke Immunosorbent Assay;聽ELISA）是把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合而发展起来的，是用酶作为标记物或指示剂，进行抗原或抗体定性 、定量测定的综合技术。
聽聽聽 与其他植物病毒的血清学检测方法相比较，ELISA的突出优点在于：1. 灵敏度高，检测浓度可达 1－10ng/ml。2.聽 专化性强、重复性好。3.聽 快速、结果可以在几个小时内得到。4. 检测对象广，一般不受抗原形态的影响。5. 适用于处理大批样 品。6. 具有自动化及试剂盒的发展潜力。
聽聽聽 ELISA聽从种类上可归为“直接”和“间接”两种。直接法就将抗原吸附在一个固相上，用 酶标记特异抗体直接检测；间接法就是先用没标记的特异抗体于固相上的抗原结合，采用标记的“第二抗体”（即抗特异抗体的结合物)聽 或 A聽 蛋白为结合物测抗原。这两种方法都是将抗原本身通过静电吸引结合在固相上（即抗原包被）， 或被事先吸附在固相上的特异抗体或抗体片段选择诱捕。
聽聽聽 ELISA 实验有多种方法：直接法（Direct method)；间接法(Indirect method)；双抗夹心法（Double聽聽 antibody聽聽 sandwich聽聽 method);聽 酶标 A聽 蛋白双抗夹心法；酶抗酶(Enzyme-anti-enzyme聽聽 method) ；异种动物抗体双夹心法；青霉素聽 (Penicillinase)酶系统；生物素（Biotin)- 亲和素（Avidin) 酶系统等。
一. 目的
聽聽聽 ELISA 试验方法是用于检测植物病毒最广泛的血清学方法之一。之中，首选的为双抗体夹心法（DAS ），灵敏度及专化性都令人满意。在 ELISA中免疫专化性通过相结合的酶与合适的底物反应表现出来。通过本实验掌握最典型的双抗体夹心法的原理及技术。
二.实验材料及用具
聽聽聽 1.ELISA 板，聚苯乙烯（PVC ）板均可用，板孔根据酶标仪设计程序采用40聽 孔或96 孔。
聽聽聽 2.特异性抗体免疫球蛋白IgG 或F（ab ＇)2 。
聽聽聽 3.酶标记抗体免疫球蛋白IgG(用HRP 或ALP 酶标记）。
聽聽聽 4.感染病毒的病株及健康植株。
聽聽聽 5.微量取液器（40－200 μl 可调，1000ul 可调，20ul 可调）；洗瓶。
聽聽聽 6.酶联免疫检测仪。台式离心机。冰箱。
聽聽聽 7.包被缓冲液；洗涤缓冲液；IgG聽 稀释缓冲液；底物溶液；邻苯二胺（OPD）；过氧化氢（H2O2 ）；2M 硫酸。
聽聽聽 8.10ml、200ml聽 量筒；5ml、10ml、100ml、500ml聽 烧杯；50ml聽 三角瓶；100ml、500ml 容量瓶；研钵；记号笔；小塑料袋；2-5ml 可调洗涤瓶。
三.缓冲液的配制
聽聽聽 1.磷酸缓冲液：用0.02MPBS（pH7.4 ），可以配成0.1M，用时稀释5倍使用。
聽聽聽 2.洗涤缓冲液：用 0.02MPBS 缓冲液（pH7.4)及 Tween20 配制。PBS－Tween 缓冲液＝1000mlPBS+0.5mlTween20。
聽聽聽 3.包被缓冲液：0.05M 碳酸盐缓冲液（pH9.6) 。4℃保存。
聽聽聽 4.酶标抗体稀释缓冲液：1000mlPBS-T+1％牛血清白蛋白（BSA ）
聽聽聽 5.底物溶液：磷酸－柠檬酸缓冲液（pH5.0)
聽聽聽 6.终止液：2－4mol/LH2SO4
四.实验步骤(用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体IgG 步骤)
1.包被抗体：在酶联板每孔中加入 200 μl聽 适宜浓度特异性抗体免疫球蛋白液(用包被缓冲液稀释：0.1MpH9.0 碳酸盐缓冲液)。加盖以防蒸发，置 37℃下孵育 2－4 小时或4℃下过夜。
2.洗涤、封闭：甩净孔中溶液，用 PBS －Tween(0.02MpH7.4聽 磷酸缓冲液＋Tween-20)冲洗反应孔，室温静置3－5 分钟后再冲洗，共重复三次。注意排除气泡。
3.加待检的抗原标样：每孔加 200 μl 待测样品，同时设阳性、阴性及空白对照。抗原稀释液为PBS－T 液。加盖4℃下孵育过夜或37℃4－6 小时。
4.洗涤：方法同上，重复三次。
5.酶标记抗体：每孔加入适宜浓度的特异性酶标记抗体 IgG200 μl,30℃下孵育 3－6 小时(酶标记抗体稀释液为PBS－T＋0.1％牛血清白蛋白)。
6.洗涤：方法同上，重复三次。
7.加底物溶液：加入 200 μl聽 新配制的底物液，室温下孵育 0.2-1聽 小时或直至显色到所需程度。
8. 终止反应：用 50 μl 适当的终止液终止反应。如底物为OPD( 或TMB) ，则用2MH2SO4终止。底物为pNPP用3MNaOH终止。聽
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9.观察结果：用肉眼观察颜色反应，并以颜色深浅记录+++，++，+，±，-或用酶联检测仪测定(O.D)吸收值。判断结果。
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