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    PFGE概述



    录入时间:2015-4-27 10:29:04 来源:青岛海博论坛论坛生物

    PFGE的作用

    聽PFGE是目前分子生物学技术在准确性,特异性,分辨率,重复性最好的方法之一。

    聽染色体DNA经过特异性限制性内切酶的酶切作用,可以产生多条10-800kb的酶切片段,通过片断的多少和大小来比较细菌的同源性。

    聽根据同源性来推断传染来源和途径;为更好的作好传染病的防治起到一定的作用。

    PFGE方法步骤

    一、胶块的制备

    1、刮取适量新培养的细菌均匀浑浊于含有1ml细胞悬浊液的eppendorf中,调整OD值至4.0

    2、取400聽μl聽CSBeppendorf管中置37度水浴中孵育5分钟。

    3、在水浴管中加于20聽μl蛋白酶K20mg/ml)使其终浓度为0,5mg/ml

    4、在eppendorf管中加入400聽μl1%Seakem聽Gold1%SDS),用枪头轻轻混匀。将混合物加入模具,避免产生气泡,室温下凝固10-15分钟。

    二、细胞的裂解

    1、每管中加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。

    2、将以制好的胶块加入管中,使其在液面下,将管子放在54 ℃水浴摇床中孵育2小时,转速约170/分钟。

    三、洗胶块

    1、从水浴摇床中取出管子,倒掉CLB,每管加入15ml预热的纯水,放回50聽℃水浴摇床中,摇15分钟。

    2、倒掉水,用纯水再洗一次。

    3、倒掉水,加入15ml预热的TE,放回50聽℃水浴摇床中,摇15分钟。

    4、倒掉TE,用TE重复洗4次,每次15分钟。

    5、倒掉TE聽,加入10mlTE,放在4聽℃冰箱保存备用。

    四、酶切

    1、小心取出TE中的胶块放干净的培养皿上。用刀片切2mm宽的胶块放入含200μl稀释液的eppendorf管中。放37聽℃水浴中孵育10-15分钟。

    2、枪头吸出稀释液,避免损伤胶块。加入200μl酶切液,并确保胶块在液面下。放37聽℃水浴中孵育至少2小时。

    五、加样

    1、制胶。

    2、聽从37聽℃水浴中取出管子,平衡到室温。吸出酶切液,加入200μl0.5聽鈽掽/span>TBE平衡。

    3、用小铲将胶块加入加样孔中。并用溶化的胶封闭加样孔。

    六、电泳

    1、电泳槽中加入2.2L聽0.5聽鈽掽/span>TBE,盖好盖子。

    2、打开主机和泵的开关。

    3、打开冷凝机,确保温度在14℃。

    4、把胶放入电泳槽,设置电泳参数。

    5、关机。

    七、分析结果

    读胶,获取图像。

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