范围

本标准规定了食品中大肠菌群的快速检验和计数方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的快速检验和计数。

规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB聽4聽78聽9.3聽食品卫生微生物学检验大肠菌群测定

GB聽4聽78聽9.28聽食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

ISO聽4聽83聽2:1991(E)聽微生物学—聽大肠菌群菌落计数法通则

术语和定义

下聽列聽术聽语和定义适用于本标准

3.1

大肠菌群coliform聽bacteria

大肠菌群是革兰氏阴性、无芽抱、氧化酶阴性的杆状细菌，为需氧和兼性厌氧，可在有胆盐(或具有其他抑制生长的表面活性剂)存在的情况下生长，通常可在36℃士2℃发酵乳糖并产酸和醛。具有件半乳糖昔酶。在本标准设定的条件下，大肠菌群为能分解R-半乳糖昔、使培养基发出荧光或生成紫色(或红色)菌落的一群革兰氏阴性无芽抱杆菌。

4聽原理

4.1聽最可能数(MPN)法

大聽肠聽菌聽群可产生各半乳糖昔酶，分解液体培养基中的酶底物—4一甲基伞形酮一各D一半乳糖普(以下简称MUGaD，使4一甲基伞形酮游离，因而，在波长366聽nm的紫外光灯照射下呈现蓝色荧光。

4.2聽平板法

大肠菌群可产生件半乳糖昔酶，分解培养基中的酶底物—聽茜素一份D-半乳糖昔(以下简称Alizgal)，使茜素游离并与固体培养基中的铝、钾、铁、钱离子结合形成紫色(或红色)的鳌合物，使菌落呈现相应的颜色。

试剂和培养基

5.1聽磷酸盐缓冲液

按聽GB聽4聽789.28-1994中3.22规定进行制备。

5.2聽生理盐水

5.2.1聽成分

氯化钠聽8.5g

蒸聽馏聽水聽10聽00m聽L

5.2.2聽制法

将氯化钠溶于蒸馏水，121'C蒸汽灭菌15m聽in,

5.3聽MUGal肉汤

5.3.1聽成分

胰蛋白胨或胰酪胨20.0聽g

氯化钠聽5.0聽g

无水磷酸氢二钾2.75聽g

无水磷酸二氢钾2.75聽g

月桂基硫酸钠0.1g

MU聽G聽.I聽(纯度不低于99%)聽0.聽08聽g

蒸馏水聽1000m聽L

5.3.2聽制法

将各成分加热溶于蒸馏水中，以15%聽20肠氢氧化钠溶液调整pH值，分装于20m聽mX聽1聽50m聽m试管，每管9聽mL,116"C蒸汽灭菌10聽min，最终pH值7.0-7.2。待培养基冷却后，以无菌手续于每管培养液内加人0.1聽m聽L经无菌水稀释的500p聽g/mL头抱磺徒液或于10聽00m聽L灭菌培养液内加1m聽L经无菌水稀释的5聽mg/mL头抱磺吮液并以无菌操作分装试管。

注聽:双聽料聽MUGal肉汤除燕馏水外，其他成分加倍。

5.4聽Aliz-gal琼脂

5.4.1聽成分

胰蛋白胨或胰酪胨20.0聽g

氯化钠聽5.0聽g

无水磷酸氢二钾2.75聽g

无水磷酸二氢钾2.75聽g

月桂基硫酸钠0.1g

Aliz-gal聽(纯度不低于97写)聽0.05聽g

异丙基硫代半乳糖昔0.03g

硫酸铝钾聽0.5聽g

柠檬酸铁钱0.5聽g

琼脂聽15.0聽g

蒸馏水聽1000m聽L

5.4.2聽制法

将各成分放入蒸馏水中，加热使溶化，以15%~聽2聽0%NaOH调整pH值，分装烧瓶,1160C燕汽灭菌10m聽in，最终pH值7.0-7.2聽

6聽设备和器材

培养箱:37℃士10℃

冷藏箱:0℃士4℃

天平:感量0.01聽g

均质器或乳钵。

平皿:直径90聽mm,

试管:20聽mm聽×150聽mm.

吸管:1.0聽ml一和10.0聽ml。

广口瓶或三角瓶:容量500聽ml

玻璃珠:直径约5聽mm

试管架

紫外灯(波长366聽nm)

其聽他

7检验程序

8聽样品的制备

8.1聽以无菌手续取25聽mL(或25聽g)样品，加于含225聽mL无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的广口瓶

(或三角瓶)内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，充分振摇或用均质器以8000r/m-10000聽r/m均质1聽min成1：10稀释液。

8.2聽用1m聽L无菌吸管吸取1，10样品稀释液1.0聽m聽L，注人含9.0聽m聽L无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的试管内，振摇均匀，即成1，10。样品稀释液。

8.3聽另取1.聽0聽mL无菌吸管，按上法制备10倍递增样品稀释液。每递增一次，换一支1.聽0聽mL无菌吸管。

8.4聽根据食品卫生标准要求或对样品污染程度的估计，选择三个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种三管培养基(MPN聽法)或两个平皿(平板法)。

9聽大肠菌群的MPN计数

9.1聽将待检样品和样品稀释液接种MUGal肉汤管，每管1.聽0聽mL(接种量在1.聽0聽mL以上者，接种双料MUGal肉汤管)。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种3管培养基。同时另取2支MUGal肉汤管(或双料MUGal肉汤管)加人与样品稀释液等量的上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)作空白对照。

9.2聽将接种后的培养管置于3TC士1'C培养箱培养18聽h-24聽h

9.3聽将培养管置于暗处，用波长366聽nm的紫外光灯照射，如显蓝色荧光，为大肠菌群阳性管;如未显蓝色荧光，则为大肠菌群阴性管。

9.4聽结果报告:根据大肠菌群阳性管数，查MPN表(见附录A)，报告每100聽m工(g)食品中大肠菌群MPN值。

10聽大肠菌群的菌落计数

10.1聽用灭菌吸管吸取待检样液1.聽0聽mL，加人无菌平皿内。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种两个平皿。

10.2聽于每个加样平皿内倾注巧mL45聽C~聽50℃的Aiiz-gal琼脂，迅速轻轻转动平皿，使混合均匀。待琼脂凝固后，再倾注3聽mL-5聽mL聽Aliz-gal琼脂覆盖表面。同时将Aliz-gal琼脂倾人加有1聽mL上述无菌磷酸盐缓冲液(或生理盐水)的无菌平皿内作空白对照。

10.3聽待琼脂凝固后，翻转平板，于37℃士1'C培养箱培养18聽h-24聽h。取出平板，计数紫色(或红色)菌落。

10.4聽结果报告

10-4.1聽当平板上的紫色(或红色)菌落数不高于150个，且其中至少有一个平板紫色(或红色)菌落不少于15个时，按式(1)计算大肠菌群数：N=∑C/(n1+n2)d

式聽中聽:

N聽—聽样品的大肠菌群数，个/mL或g;

∑C聽—聽所有计数平板上，紫色(或红色)菌落数之总和;

n1聽—聽供计数的最低稀释倍数的平板数;

n2聽—聽供计数的高一稀释倍数的平板数;

d—聽供计数的样品最低稀释度(如10-1,10-2,10-3等)

10.4.2聽如接种所有(3个)稀释样品的平板上，紫色(或红色)菌落数均少于15个时，仍按式(1)计算，但应在所得结果旁加“‘”号，表示为估计值。

10.4.3聽如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，紫色(或红色)菌落数均少于15个时，报告结果为:每毫升(克)样品少于15个大肠菌群。

10.4.4聽如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，均未发现紫色(或红色)菌落数时，报告结果为:每毫升(克)样品少于1个大肠菌群。

10.4.5聽如平板上的紫色(或红色)菌落数高于15个时，按式(1)计算，在结果旁加“，”号表示估计值或视情况重新选择较高的稀释倍数进行测定。

聽

聽

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